［摘要］目的：研究不同光質對靈芝菌絲體生長及抗氧化酶活性的影響，為靈芝菌絲體培養提供科學的理論依據。方法：采用新型半導體發光二極管（LED）光源設置不同光質處理，動態觀測靈芝菌絲體生長、多糖含量及抗氧化酶活性變化。結果：藍光處理及黑暗對照條件下靈芝菌絲體生長較快，黑暗對照條件下菌絲體形態纖細、菌落淡薄，藍光、白光處理菌絲體粗壯、菌落濃密。白光處理菌絲體生物量積累最高，藍光次之。綠光處理靈芝菌絲體POD酶活性波動變化較大，生長中后期顯著高于其他處理。白光處理菌絲體CAT酶在生長過程中始終保持較高活性。生長前期黃光處理菌絲體SOD酶活性最高，后期黑暗對照SOD酶活性較高。前期綠光處理菌絲體多糖含量較高，生長后期藍光處理菌絲體多糖含量顯著高于其他處理。結論：光質影響靈芝菌絲體生長代謝，藍光利于靈芝菌絲體生長代謝。
［關鍵詞］靈芝；光質；發光二極管；生長；抗氧化酶活性；靈芝多糖
光作為重要的環境因子，通過光強、光周期和光質影響生物生存與發展。光質即不同波長光譜成分［1］。近年來，國內外有關光質的研究已成為熱點［2-3］，但關于真菌方面研究報道較少。
靈芝Ganodermalucidum屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬真菌，在我國有2000多年藥用歷史，其子實體、孢子、菌絲體均可入藥［4］。傳統上靈芝菌絲體在黑暗條件下培養，本文選用光質純、光效高、波長固定、發熱低［5］的發光二極管（LED）光源設置光質條件，研究不同光質處理靈芝菌絲體生長及抗氧化酶活性差異，為靈芝菌絲體培養提供理論依據。
1材料
供試菌株S3靈芝菌株，由中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所生物發酵實驗室提供，該菌株經太空搭載，具有優質高產特性和穩定遺傳性。
2方法
2.1光質選擇及處理條件
LED光源購自淄博曙光科技公司，功率24W，分為紅光R、藍光B、黃光Y、綠光G及白光W5個處理，設黑暗為對照。不同光質波長采用美國產ASDFieldSpecHandHeld光譜分析儀測定。培養架高度一致，光源均勻分布于頂部，外層由黑色遮光材料覆蓋。
2.2培養基及培養條件
2.2.1供試培養基 ①母種培養基：保藏母種采用PDA培養基。②實驗培養基：每1L水中加入麩皮50g（煮后濾汁）；葡萄糖20g；馬鈴薯100g（煮后濾汁）；瓊脂粉16g；VitB120mg；MgSO4·7H2O1.5g；KH2PO43g，pH約7.0。
2.2.2培養條件 超凈工作臺下，將實驗培養基定量裝入直徑12cm的培養皿中，裝液量50mL。凝固后，接入菌齡一致直徑1cm的圓形母種菌塊。不同光質處理培養12d，培養溫度25℃。
2.3靈芝菌絲體生長速度及生物量測定
2.3.1生長速度觀測 培養后第4天起，不同光質處理隨機取樣，采用十字交叉法每1d測定1次菌落直徑并觀察各處理菌落形態至第12天結束，每個處理重復3次。
2.3.2生物量測定 培養后第6天起，不同光質處理隨機取樣，采用烘干恒重法每2d測其生物量1次至第12天結束，每個處理重復3次。
2.4 靈芝菌絲體POD，CAT，SOD酶活性
測定培養后第6天起，不同光質處理每2d隨機取樣1次。至第12天結束，分別測其POD，CAT，SOD酶活性。
2.4.1POD酶活性測定 準確稱取鮮重樣品0.1g，加入3mLPBS緩沖液（pH6.0）冰浴研磨，于4℃下10000r·min－1離心15min，取上清液即酶提取液，采用“愈創木酚法”［6］測定其POD酶活，每個處理重復3次。
2.4.2CAT酶活性測定 準確稱取鮮重樣品0.1g，加入3mLPBS緩沖液（pH7.8）冰浴研磨，于4℃下8000r·min－1離心15min，取上清液即酶提取液，采用Cakmark方法［7］測定其CAT酶活，每個處理重復3次。
2.4.3SOD酶活性測定 準確稱取鮮重樣品0.1g，加入3mLTris緩沖液（pH8.2）冰浴研磨，于4℃下4000r·min－1離心15min，取上清液即酶提取液，采用“鄰苯三酚自氧化法”［8］測定其SOD酶活，每個處理重復3次。
2.5靈芝菌絲體多糖含量測定
培養后第6天起至第12天結束，不同光質處理每2d隨機取樣1次，于60℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩，作為測定菌絲體多糖含量樣品。精確稱取樣品0.1g加入10mL無水乙醇，60℃恒溫水浴30min。過濾取濾渣，加入20mL蒸餾水，95℃恒溫水浴振蕩提取2h，過濾，取濾液定容至25mL，得待測樣品溶液。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=5.832X－0.0328（R2=0.9941）。采用苯酚-硫酸法［9］對各處理樣品多糖含量進行測定，每個處理重復3次。
2.6數據分析
采用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行統計分析。Duncan新復極差法比較各處理間及處理與對照間差異。
3結果與分析
3.1LED光質對靈芝菌絲體生長影響
黑暗對照條件下靈芝菌絲體前期生長較快，后期生長速度明顯下降。培養后第9天黑暗對照和藍光處理靈芝菌絲體長滿培養皿，菌落直徑達12cm。綠光處理菌絲體生長最慢，至第9天菌落直徑僅9.12cm。菌落形態方面，黑暗對照條件下菌落生長淡薄，菌絲纖細呈螺旋狀。藍光、白光處理菌落生長濃密，菌絲呈匍匐狀。紅光處理菌落輪紋狀生長，菌絲呈絨毛狀，見圖1。
3.2LED光質對靈芝菌絲體生物量積累影響
靈芝菌絲體生長過程中生物量積累呈“S”形變化，前期積累較快，中期積累速度放緩，后期有所升高。白光處理靈芝菌絲體在整個生長過程中生物量始終保持最高，藍光處理次之。黃光、綠光處理菌絲體在生長中期生物量積累較高，后期積累速度下降明顯，見圖2。
3.3LED光質對靈芝菌絲體抗氧化酶活性影響
3.3.1對POD酶活性影響 不同LED光質處理靈芝菌絲體POD酶活性總體表現先升后降趨勢。培養至第8天紅光、黃光、綠光及黑暗對照條件下POD酶活性均達到最大值。綠光處理靈芝菌絲體POD酶活性變化較大，第6天綠光處理菌絲體POD酶活性顯著低于其他處理，第8天和第10天其POD酶活性顯著高于其他處理。黑暗對照條件下菌絲體在整個生長過程中POD酶始終表現較低活性，見圖3。
3.3.2對CAT酶活性影響 各LED光質處理靈芝菌絲體CAT酶活性總體表現逐漸降低趨勢。培養至第6天各光質處理菌絲體CAT酶活性均達到最高，大小依次為綠光＞白光＞藍光＞黑暗對照＞黃光＞紅光，見圖4。第8天白光處理菌絲體CAT酶活性顯著高于其他處理及黑暗對照。紅光處理靈芝菌絲體生長前期CAT酶表現較低活性，后期黃光處理CAT酶活性較低。
3.3.3對SOD酶活性影響 靈芝菌絲體SOD酶活性隨培養時間延長逐漸升高。黃光處理菌絲體第10天SOD酶活性達到最高且顯著高于其他處理及黑暗對照，第12天其酶活性有所下降。其他處理及黑暗對照條件下菌絲體至第12天SOD酶活性達到頂峰，第12天黑暗對照條件下靈芝菌絲體SOD酶活性最高，達到104.04U·g－1·min－1，見圖5
3.4LED光質對靈芝菌絲體多糖含量影響
不同LED光質處理靈芝菌絲體多糖含量達到最大值的時間不同。綠光處理第8天菌絲體多糖含量達到最大，顯著高于其他處理及黑暗對照。藍光處理第10天菌絲體含量最高且顯著高于其他處理及黑暗對照。黑暗對照條件下菌絲體多糖含量始終保持較低水平，見表1。
4討論
研究發現，藍光處理和黑暗對照條件下靈芝菌絲體生長較快，黑暗對照條件下菌絲體形態呈螺旋狀、菌落淡薄，生物量積累較慢。白光和藍光處理靈芝菌落濃密，菌絲體生長粗壯呈匍匐狀且生物量積累較快，其中白光處理生物量積累最快。可見，混合光照射靈芝菌絲體生長可加快其生物量積累。不同光質處理靈芝菌絲體多糖含量最高值出現的時間不同，綜合分析藍光利于靈芝菌絲體多糖合成。
POD，CAT，SOD是生物體內主要保護酶類，有清除自由基，維持膜系統完整性，減輕不良環境對生物傷害等作用。研究表明，不同光質處理靈芝菌絲體POD，CAT酶活性高峰分別出現在第6天和第8天，結合菌絲體生長速度和生物量積累分析，此時期正值菌絲體生長高峰。這與文獻報道［10-11］，愈傷組織POD，CAT活性最高值標志其生長高峰到來的觀點基本一致。綠光在靈芝菌絲體生長中后期POD酶活性保持較高水平，說明綠光對菌絲體生長形成逆境。第6天不同光質處理菌絲體CAT酶活均達到最高值，白光處理菌絲體CAT酶活始終高于其他處理和黑暗對照，表明白光下菌絲體過早老化。靈芝菌絲體生長過程中SOD酶活性隨培養時間延長逐漸升高，與植物生長過程中SOD酶活變化出現2個波峰的結論［12］不一致，初步推測是植物與真菌遺傳背景和代謝途徑差異造成。整個生長過程中黃光處理菌絲體SOD酶始終處于較高水平，表明黃光不利于靈芝菌絲體生長。