上世紀80年代，共聚焦顯微技術的發明將激光器帶進了生命科學實驗室，采用連續波藍光和綠光氬離子激光器進行細胞結構成像，可以獲得傳統白光照明方式無法達到的高分辨率。1990年，多光子激發顯微（MPE）技術的出現[1]，自然而然地引入了超快激光器，引起了生命科學研究的重大變革。這是由于，首先，美國和歐洲的生物研究經費培育了激光應用技術的快速增長；同時，這些過去比較復雜的激光器的使用者并不是激光專家，這也在促使激光產業界專門設計操作簡便、可靠性高的高性能產品。例如，Coherent公司就以“優異超快每一天”的標準推出了一系列產品，以滿足生命科學市場的需求。本文將介紹激光技術的創新與生命科學成像是如何互相促進、共同發展的。
圖1. 單光子和雙光子激發機制對比。
共聚焦顯微技術已廣為人知，下面將側重介紹使用輸出超短脈沖寬度、高峰值功率的紅外激光器，以取代連續波藍綠光激光器的MPE技術。MPE的基本原理是采用2個或3個紅外波段的光子，而不是單個紫外到綠光波段的光子，來激發樣品中附著的染料產生熒光（見圖1）。大部分染料最初都是為了使用紫外、藍光或綠光的離子激光器激發設計的，而采用2個甚至3個光子激發就需要MPE激光器的輸出波長在700～1000nm范圍，也就是鈦寶石激光器的輸出波段。同時，由于MPE是一個非線性過程，要求激光脈沖具有很短的脈沖寬度以獲得很高的峰值功率，至少幾十至幾百毫瓦的平均功率，以及很高的重復頻率（10～100MHz）以獲得很快的數據采集速度。那么，脈沖寬度需要多短呢？理想情況下是越短越好，一般在幾十飛秒到幾皮秒之間。雙光子激發下，熒光信號的強度由以下關系式決定：
圖2. 水和常見生物組織對激光的吸收。
其中，Pave是到達樣品處的激光平均功率，是到達樣品處的激光脈沖寬度。由此可見，有兩種方法可以增強熒光信號強度――提高平均功率和縮短脈沖寬度。由于熒光強度與平均功率的平方成正比，前一種方法更為有效。
大部分人都認同MPE的主要優點是：既可以獲得更深的組織穿透深度，又可以減少激光對細胞結構的損傷。穿透深度的提高是由于采用了紅外光激發，可以到達500～800?m深處，比采用藍綠激光的單光子共聚焦顯微技術要深得多。而損傷的減少是由于紅外光子能量比UV或藍綠光子低，也就不容易引起對生物細胞的光化學損傷（見圖2）。當然，在焦點位置（像平面）紅外光子也有可能引起多光子激發損傷，但由于在焦點以外的區域幾乎沒有多光子吸收，在整個細胞樣品中的總損傷比單光子激發時要小得多。
近幾年來，業界對MPE技術、方法、材料和激光光源的研究取得了長足的進展。下面將針對激光光源的選擇介紹以下幾個領域的進展：
1） 深層組織成像：波長、平均功率和脈沖寬度的影響
2） 提高樣品活性
3） 新型成像技術
圖3. Chameleon和Chameleon OPO的輸出功率和調諧范圍。
深層組織成像
雖然水對波長大于500nm的光吸收隨波長的增加而增強，但由于血液、黑色素及表皮等對波長大于1000nm（1?m）的光吸收隨波長的增加而減弱（見圖2），因此波長在1.1～1.35?m范圍的激光在很多組織中的穿透深度最深。由于鈦寶石激光器的調諧范圍最多只能達到1080nm，使用鈦寶石激光器泵浦的光參量振蕩器（OPO）是將調諧范圍擴展到1.5?m的最佳方法。例如，采用Chameleon OPO可以將Chameleon的調諧范圍擴展到1～1.5?m，同時只需要很少的用戶調節。高功率鈦寶石激光器如Chameleon Ultra II與Chameleon OPO配合使用，可以在整個調諧范圍中提供足夠的激發功率（見圖3）。
另外一種提高穿透深度的方法是使用脈沖能量更高（微焦耳量級）、重復頻率較低（100～200kHz）的激光器。Beaurepaire [2]和Denk [3]分別在2001年和2002年對此進行了模擬計算和實驗驗證。兩個研究組都使用了Coherent公司的RegA 9000再生放大器，其中Denk在老鼠活腦細胞中獲得了1mm的驚人穿透深度。
同時，研究人員也試圖通過縮短到達樣品處的脈沖寬度來提高熒光信號強度。激光器輸出的超短（<1ps）脈沖通過顯微鏡物鏡和光調制器時都會受到“群速度色散”（GVD）的影響，例如150fs的脈沖到達樣品后會被展寬到250～350fs，更短的脈沖（如50fs）甚至會被展寬到1ps以上。Coherent公司的Chameleon設計為產生140fs的脈寬輸出，因為具有這個脈寬的激光在大多數顯微鏡系統中只會受到很小的展寬。如果想要減小GVD的影響，可以采用預補償技術，就是在激光脈沖傳輸到顯微鏡系統之前引入負色散，以抵消系統中的正色散。專門為MPE應用設計的高功率激光器（Chameleon Ultra系列）與預補償技術（Chameleon PreComp）相結合，使現在的MPE研究者可以同時擁有高平均功率和短脈沖寬度，以獲得最佳的熒光信號。
最近，Dantus教授的研究組[4]使用輸出脈寬10fs、帶寬100nm的超快激光器，以獲得更強的熒光信號。脈寬10fs的激光脈沖具有100nm的帶寬，從而不僅需要進行GVD預補償，還需要對脈沖進行相位和強度整形，以補償3階和高階的色散。這樣的實驗就需要新一代寬帶寬超快激光器（如Coherent的Micra），以及脈沖整形附件（如Coherent的Silhouette）。
最后需要強調的是，無論是通過提高平均功率還是采用縮短脈沖寬度的方法來獲得更深層的組織成像，損傷活體樣品的風險是相同的，因為只有讓染料通過雙光子或者三光子過程吸收更多能量才能獲得更強的熒光信號，而很強的激發就有可能導致光損傷。另外，使用更長的激發波長可以在增加穿透深度的同時提高細胞活性。
樣品活性
自從上世紀90年代成功地將熒光蛋白（如GFP）附著在活細胞上以來，人們逐漸認識到MPE中降低生物樣品損傷的重要性。同傳統染料相比，使用可可以發出各種顏色熒光的蛋白質可以顯著提高細胞活性。繼最早應用的綠色和藍綠色熒光蛋白之后，科學家又分離和創造出很多種不同的熒光蛋白，目前的發展趨勢是使用黃光和紅光波段的蛋白[5]，因為它們不僅能擴充成像的色彩種類，而且可以采用更長的激發波長（> 1000nm），有利于深層組織成像。
對細胞損傷的量化評估并不容易。實驗證明[6]，在其他所有條件相同的前提下，采用波長1250nm的飛秒激光脈沖激發，所導致的細胞損傷比采用波長800nm激發要小得多（見圖4）。兩三年以前，產生長波長的激光和獲得長波長的熒光蛋白都很困難；而現在可以輕松獲得1080nm（如Chameleon Ultra II）甚至1500nm（如Chameleon OPO）的波長，以及Ds Red、mcherry等長波長熒光蛋白的出現，使得MPE技術穿透深度深和樣品活性高的優勢可以充分發揮。相信這一趨勢會繼續發展，并出現更長的激發波長和更多種類的蛋白和染料。
圖4. 細胞損傷與激發波長的關系（▲代表1250nm激光激發，代表800nm激發，脈沖寬度和平均功率相同）。
新型成像技術
為了進一步降低樣品損傷，更為激進的方式就是不采用任何熒光標志物，而利用樣品的本征熒光或者其他非線性效應成像。其中最常用的技術有二倍頻（SHG）、三倍頻（THG）和相干反斯托克斯拉曼光譜（CARS）顯微技術。
SHG和THG顯微技術可以采用與MPE實驗相同的激光器和顯微鏡，當然激光器、顯微鏡和探測器的工作波段必須符合要求。在SHG和THG顯微中，對比度來自于超快激光激發下不同生物結構的SHG和THG強度的差異。例如，膠原蛋白或者任何的細胞界面都可以產生可測量的SHG信號；微米尺度以下的細胞內含物或者界面上都可以產生THG信號。THG顯微已被成功應用于活胚胎的無損成像[7]。SHG顯微中，信號頻率是激光頻率的兩倍，即波長是激光波長的一半；THG顯微中，信號頻率則是激光頻率的三倍，即波長是激光波長的三分之一。舉例來說，采用1.2?m波長的激光激發，SHG顯微信號波長是600nm，而THG顯微信號波長是400nm。SHG和THG顯微對激發波長沒有限制，因此可以自由選擇激發波長以同時獲得強信號和弱損傷，例如采用1?m以上的紅外波長激發，而仍然在可見波段探測。THG顯微是三光子激發過程，同雙光子激發的SHG顯微或MPE相比，需要更高的激光功率。Coherent公司的OPO產品已經被用于多個THG顯微實驗。
圖5. CARS中的四波混頻（p為泵浦光，s為斯托克斯光，as為反斯托克斯光，R為分子的特征拉曼位移）
CARS是一個四波混頻過程，需要使用兩臺波長不同而完全同步的激光器產生三束激光，其中兩束波長相同，稱為“泵浦光”，第三束稱為“斯托克斯光”，在它們的共同作用下獲得第四束信號光，即反斯托克斯光[8]（見圖5）。泵浦光和斯托克斯光的頻率差必須精確調節，以產生樣品分子的特征反斯托克斯信號，使包含該分子的細胞結構在顯微鏡下成更亮的像。由于沒有使用任何染色劑，采用CARS顯微可以比MPE顯微研究更多的活細胞分子特性。CARS顯微已被廣泛應用于脂類成像，而且原則上只要激光波長調諧的范圍允許，可以應用于各種樣品。CARS顯微一般采用皮秒激光而不是飛秒激光，因為CARS躍遷的線寬僅有不到一個納米，與皮秒激光脈沖的光譜帶寬相匹配。最常見的CARS顯微系統使用一臺1064nm的皮秒激光器及其泵浦的OPO，或者采用兩臺OPO的信號光和閑置光輸出。然而，CARS和其他四波混頻技術（如受激參量發射顯微[8]）也可以采用超寬帶寬的飛秒激光器（如Coherent公司的Micra），以及脈沖整形器，以選擇寬帶寬中同一波段的兩個分立波長產生非線性信號。采用這種方法只需要一臺激光器就可以產生兩個甚至更多波長來激發樣品，大大簡化了激光器系統的復雜性。雖然CARS與MPE顯微采用的激光器系統不同，但MPE顯微鏡可以改造為適用于CARS顯微的樣式。
綜上所述，過去的15年來，多種非線性光學技術被應用于生命科學研究。其中，MPE技術最為成熟，也已經被廣泛使用。激光器制造商開發出專用的尖端超快激光器，如Coherent公司的Chameleon，以適應和推動MPE技術的進步。同時，其他非線性光學技術的發展也進一步擴展了MPE的優勢，并獲得了新的分析能力。